冷浸渍和酒精发酵中非酿酒酵母的种类及数量的动态变化

  

张方方翻译

     摘要

     本文主要研究葡萄醪中酵母的生态菌群特征,在冷浸渍过程中温度和添加干酵母的时间对非酿酒酵母种类和动态数量的影响。研究表明在葡萄酒酿造生产中波尔多地区非酿酒酵母在冷浸渍和酒精发酵过程中非酿酒酵母不断变化。在冷浸过程中,非酿酒酵母的数量在104–105 CFU/mL范围,酒精发酵开始时,非酿酒酵母的数量到达最大,为106–107 CFU/mL,随着酒精发酵数量下降,酒精发酵结束时非酿酒酵母的数量在103–104 CFU/ mL,该数量取决于酿酒酵母的接种时间。温度是控制冷浸渍后期酵母数量和种类的因素。2005和2006年份的美乐葡萄中主要的非酿酒酵母是Hanseniaspora uvarum,同时2006年也有大量的Candida zemplinina。本研究分离了19种不同种类的酵母。

  1 引言

     酵母存在于葡萄浆果的表面,气候条件和不同的成熟时期影响着酵母的数量。在葡萄采收时,酵母种类复杂,但负责发酵的酿酒酵母并不多。研究表明酿酒酵母仅占总酵母数的千分之一。因此在发酵早期非酿酒酵母占优势地位。

     大量的研究表明非酿酒酵母存在于葡萄酒生态系统中,且葡萄的环境影响非酿酒酵母的种类及数量。研究证明葡萄孢菌病害改变微生物的种类,同时葡萄成熟度对酵母种类和数量也有影响。葡萄酒发酵初期酵母种类具有多样化,包含Hanseniaspora(anamorph Kloeckera), Candida, Pichia, Metschnikowia, Kluyveromyces, Issatchenkia等酵母。

     近年来,非酿酒酵母越来越多的用于葡萄酒的酿造中,研究显示非酿酒酵母具有改善葡萄酒风味的能力,且非酿酒酵母分泌有益的酶。学者已经研究了酿酒酵母与非酿酒酵母的混合发酵。

     酵母在葡萄酿造中的发展变化已经进行了研究,但文献较少。冷浸渍被世界范围的用于红葡萄酒的生产,该技术是在特定的低温(未明确规定)条件下,进行一定时间(未明确规定)的浸渍。冷浸渍有助于提高葡萄酒的颜色,在一些文献报道中已经证明其能提高不同红葡萄品种的酒的颜色。冷浸渍提高桃红葡萄酒中的单萜含量。冷浸渍初期微生物的菌群最初是来源于葡萄,并受到酒窖表面酵母菌群的影响。

     本研究探讨葡萄酒中酵母的菌群特征,分析冷浸渍过程中酵母种类和多样性,以及添加酵母的时间、冷浸渍的温度对酵母生态系统的影响,酵母种类鉴定使用PCR-ITS-RFLP结合特定区域的测序的方法鉴定。

      2 材料与方法

      2.1 冷浸渍中酵母的动态及种类

     波尔多地区酒厂I和II中2005和2006年份美乐葡萄。冷浸渍温度15°C,冷浸渍结束加入酵母,监测冷浸渍过程中每天酵母的动态变化,酒精发酵开始、中期和末期酵母的动态变化。

      2.2 酵母添加时间和浸渍温度的影响

     在2006年份酒厂I的三个发酵罐(A、B、C)进行研究,A为对照,没有冷浸渍,接种商业酵母200mg/l立即开始酒精发酵。B罐冷浸渍前加入商业酵母200mg/l,冷浸渍3天后出现发酵现象。C罐冷浸渍6后接种商业酵母200 mg/L启动酒精发酵。浸渍温度保持在15°C。

     温度对冷浸渍的影响研究,在实验室条件下,在2L消毒的玻璃罐中发酵。收集A罐中压榨的新鲜葡萄醪,经过均质化、添加二氧化硫。罐子里装1.5L葡萄醪(半厌氧条件下),保持在4°C、10 C°和15 C°6天。浸渍后接种商业酵母200mg/l发酵,发酵温度为25°C,两次重复。冷浸渍期间每天取样,酒精发酵时期在发酵开始、中期和后期取样。

     3 结论

      该研究的目的是调查冷浸渍和酒精发酵过程中酵母的动态变化和多样性以及冷浸渍的温度、干酵母的添加时间对非酿酒酵母数量及多样性的影响。

      研究显示非酿酒酵母(NS)在冷浸渍(CM)早期是稳定的,并在后期略有增长。非酿酒酵母在酒精发酵开始时达到最大,并在酒精发酵后期的数量在103–5×104CFU/mL之间。

  

图1 冷浸渍和酒精发酵过程中酵母总数和非酿酒酵母数量的变化(酒厂I,2005年份美乐葡萄),0h/d表示酵母添加时间,—h/d表示冷浸渍时间,+h/d表示酒精发酵时间

  

图2、冷浸渍过程中酵母种类及数量的变化(酒厂I,2005年份美乐葡萄),0h/d表示酵母添加时间,—h/d表示冷浸渍时间,+h/d表示酒精发酵时间

  

  

图3、冷浸渍过程中酵母种类和数量的变化(酒厂II ,2006年美乐葡萄),0h/d表示酵母添加时间,—h/d表示冷浸渍时间,+h/d表示酒精发酵时间

  在这项研究中,比较了三种不同的冷浸渍温度:4°C,10°C,和15°C,表明,冷浸渍温度降到10°C可能控制整个冷浸渍酵母细胞的生长,但再低的温度是不必要的。氧因子不在本研究的范围,但也可能是非酿酒酵母生长和生存的一个关键参数。

  

图4 冷浸渍和酒精发酵过程中温度对于酵母总数(图A)和非酿酒酵母(图B)数量的影响(CM为冷浸渍,AF为酒精发酵)

  

图5 144小时后(-1d)不同温度冷浸渍后非酿酒酵母种类分布的比例(2006年, 美乐)

  波尔多地区干酵母有两种添加时期:一种是添加在冷浸渍之前,另一种是添加到冷浸渍之后。这项研究中表明冷浸渍之前添加干酵母使得酒精发酵后期非酿酒酵母数量较低。这个现象可能是酿酒酵母与非酿酒酵母之间相互作用引起的。研究表明酵母细胞之间存在相互作用或群体感应。酵母之间的相互作用还需要继续研究。

  

图6不同的冷浸渍和不同的接种处理对酵母总数和非酿酒酵母及数量的变化的影响(酒厂I,2006年份美乐葡萄;A 没有进行冷浸渍,立即接种酵母发酵;B酵母接种与冷浸渍同时进行;C冷浸渍后接种酵母)

     在冷浸渍过程中,非酿酒酵母为主导优势酵母,且非酿酒酵母种类具有多样性。在冷浸渍开始时酵母种类最丰富,冷浸渍后期多样性下降。在冷浸渍及酒精发酵中共分离了19中不同种类的酵母。每一种酵母都需要深入的研究其生长特性。2005年份的葡萄中主要分布的酵母是H. uvarumL. elongisporus,其中L. elongisporus在葡萄酒瓶储中存在,本研究是第一次在未发酵的冷浸渍的葡萄醪中分离出。2006年分的葡萄中主要的酵母种类是H. uvarum C. zemplinina,其中H. uvarum具有产生酯类物质的特性,但是也产生挥发酸。同时也发现了Hanseniaspora guilliermondii, Cryptococcus albidus, P. anomala, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia fermentans, Hanseniaspora spp., P. membranifaciens, I. orientalis, M. pulcherrima, Z. hellenicus,Candida spp., 和D. hansenii 等非酿酒酵母。这些酵母通常被称为葡萄酒相关酵母。同时也分离出C. pararugosa C. parapsilosis,这类酵母通常与皮肤损伤有关,最近也发现于葡萄酒生态系统中。C. pararugosa曾在人的粪便中分离,之前从未在葡萄酒相关领域分离出。这就提出了酵母来源的问题,人为因素(葡萄筛选、处理酒,等)可能是另一个非酿酒酵母的来源,这已经在在酒窖中得到证明。

     在几个样本中分离出A. schoenii(即Saccharomycopsis schoeniiPichia nonfermentans)酵母,这类酵母在意大利的腐败的葡萄中发现,但在葡萄园和葡萄酒中没有发现。T. delbrueckii 是一种非常有益的非酿酒酵母,通常与酿酒酵母共同发酵,该酵母能降低甜型葡萄酒的挥发酸的含量,这种酵母也发现于几个葡萄样本中,但其数量较小。Hierro et al. (2006)研究了4°C冷浸渍非酿酒酵母的种类,该研究发现西班牙Tarragona 地区2002年份的冷浸渍的Tempranillo 葡萄中存在大量的H. uvarumCandida stellata。本次的研究发现4 °C有利于C. zemplinina的生长,该酵母种最初发现于贵腐的葡萄和葡萄醪中。研究表明C. zemplinina菌种具有耐高渗透和低温的特性。

     冷浸法主要用于提高酒的颜色和香气质量。几项研究聚焦于非酿酒酵母产酯类化合物性能。同时非酿酒酵母也被证明可以用于提升葡萄酒的味觉特性。酿酒酵母具有分泌多种酶的能力,如H. uvarum分泌β-葡萄糖苷酶和蛋白酶,这些酶在葡萄酒香气中具有重要作用。而S. cerevisiae是公认不具有分泌胞外蛋白酶、脂肪酶或蛋白水解酶能力。冷浸渍初期非酿酒酵母占主导地位,冷浸渍几天后,葡萄中固有的酿酒酵母数量增加,并在接种酵母时占优势地位。在自然发酵或接种酿酒酵母的酒精发酵中,非酿酒酵母的数量占总菌落数的1-10%。因此,非酿酒酵母对葡萄酒质量的影响在葡萄酒酿造的早期,如冷浸渍时,酒精发酵过程中非酿酒酵母的作用将下降。

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